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蛋白质印迹——膜选择

2022.11.29 点击3503次

PVDF膜和NC膜作为Western印迹应用中最常用的两种类型的膜，各有什么特点？我们该如何选择？

印迹所使用的膜的类型可能影响下列因素：

•蛋白质结合能力

•是否需要用醇预湿

•开展多次剥离(stripping)和再生检测(reprobing)实验的能力

•蛋白质观察

•长期印迹保存

•信噪比

聚偏二氟乙烯(PVDF)和硝酸纤维素是Western印迹应用中最常用的两种类型的膜。

与硝酸纤维素膜相比，电转到PVDF膜上有许多优点。PVDF膜可提供更好的蛋白质截留率、物理强度和广泛的化学兼容性(Pluskal等，1986)。其中更高的机械强度和出色的耐化学性让PVDF膜成为免疫检测中各种染色应用和二次检测的理想选择。使用PVDF膜的另一个优点是，单块凝胶上的平行重复泳道可用于各种应用中，如考马斯蓝染色，接着切割条带进行N端测序，蛋白质水解/肽段分离/内部测序，以及免疫检测(Kurien等，2003)。市售的硝酸纤维素膜的典型结合能力是80 – 100 μg/cm²，而PVDF膜的结合能力是100 – 200 μg/cm²。

在检测血清中人免疫缺陷病毒(HIV)时直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，结果表明，PVDF膜有着更好的总体HIV抗原截留率，并且有助于改善提高抗体对糖基化包膜抗原的检测(Lauritzen和 Pluskal，1998)。硝酸纤维素膜和PVDF膜的特性比较详见表1。

表1. PVDF和硝酸纤维素膜特性及应用的比较

特性/应用	硝酸纤维素	PVDF
物理强度	差	好
蛋白质结合能力	80 – 100 μg/cm²	100 – 300 μg/cm²
耐溶剂性	否	是
Western转移	是	是
总蛋白染料	胶体金	胶体金
	丽春红	丽春红
	氨基黑	氨基黑
	印度墨汁	印度墨汁
	Sypro^®印迹染料	考马斯蓝染料
检测	显色	显色
	化学发光	化学发光
	荧光	荧光
	放射性	化学荧光
		放射性
双印迹方法	否	是
快速免疫检测	否	是
Western再次杂交	是	是
Edman测序	否	是
氨基酸分析	是	是
SDS存在下的结合	差	好
膜上消化或质谱分析	否	是
直接MALDI^-TOF MS分析	否	是
数据可存档	否	是

默克密理博提供四种PVDF膜：

• Immobilon®-P膜(0.45 μm)是一种通用的基质，适用于一般的免疫印迹应用。

• Immobilon®-PSQ膜(0.2 μm)适用于蛋白质测序和低分子量蛋白的免疫印迹。它有着更高的蛋白质结合能力以及比0.45 μm膜更高的截留率。

• Immobilon®-FL膜(0.45 μm)是为荧光免疫检测而开发的。它在多种激发和发射波长范围内的荧光背景都极低。

• Immobilon®-E膜(0.45 μm)是第一个用于蛋白质印迹的PVDF膜，可以用水性转移缓冲液润湿。这省去了其他PVDF膜所需的酒精预湿步骤。

Immobilon®转印膜以卷膜和方片膜形式提供。预切好的膜与所有预制胶以及大部分市售的凝胶电泳系统兼容。Immobilon®转印膜的性质详见表2。表3列出了与最常用的电泳系统相匹配的Immobilon®预切膜的尺寸。表4列出了与现有的预制胶相匹配的Immobilon®预切膜的尺寸。

表2. Immobilon® PVDF转印膜的性质和应用

	Immobilon^®-P转印膜	Immobilon^®-PSQ转印膜	Immobilon^®-FL转印膜	Immobilon®-E PVDF膜
描述	为结合从各种凝胶基质上转移的蛋白质而优化	均一的孔径结构带来分子量<20 kDa的蛋白质的出色结合	为荧光免疫检测应用而优化	首个用于蛋白质印迹的PVDF膜，可以用水性转移缓冲液润湿
组成	PVDF	PVDF	PVDF	PVDF
孔径大小	0.45 μm	0.2 μm	0.45 μm	0.45 μm
疏水性	疏水	疏水	疏水	疏水
应用	Western印迹	低分子量	Western印迹	Western印迹
	结合分析	Western印迹	斑点/狭缝印迹
	氨基酸分析	氨基酸分析	荧光免疫检测
	N端蛋白测序	质谱分析
	斑点/狭缝印迹	N端蛋白测序
	糖蛋白观察
	脂多糖分析
	质谱分析
检测方法	显色	显色	荧光	化学发光
	化学荧光	荧光	显色	显色
	化学发光	化学荧光	化学荧光	放射性
	放射性	化学发光	化学发光
		放射性
蛋白质结合能力	胰岛素：160 μg/cm²	胰岛素：262 μg/cm²	胰岛素：155 μg/cm²	胰岛素：160 μg/cm²
	BSA：215 μg/cm²	BSA：340 μg/cm²	BSA：205 μg/cm²	BSA：215 μg/cm²
	山羊IgG：294 μg/cm²	山羊IgG：448 μg/cm²	山羊IgG：300 μg/cm²	山羊IgG：294 μg/cm²
兼容的可逆染料	透射法	透射法	透射法	透射法
	丽春红	丽春红	丽春红	丽春红
	CPTS	CPTS	CPTS	Sypro® ruby
	甲苯胺蓝	甲苯胺蓝	Sypro印迹染料
	Sypro^®印迹染料	Sypro印迹染料
兼容的不可逆染料	考马斯亮蓝染料	考马斯亮蓝染料	考马斯亮蓝染料	考马斯亮蓝
	氨基黑	氨基黑	氨基黑	氨基黑
	印度墨汁	印度墨汁		印度墨汁
	胶体金	胶体金		胶体金

表3. Immobilon® PVDF预切转印膜和匹配的电泳系统

Manufacturer	Vertical Gel Box	Gel size(cm)	Immobilon® Size (cm)	Immobilon® NOW format compatible	Immobilon®-P 0.45 μm	Immobilon®-PSQ 0.2 μm	Immobilon®-FL 0.45 μm*	Immobilon®-E 0.45 μm
GE Healthcare	SE 250 Mighty Small™	8 × 7	8.4 × 7	■	IPVH07850	ISEQ07850	IPFL07810	IEVH07850
	SE 260 Mighty Small™	8 × 9.5	8 × 10		IPVH08100	ISEQ08100		IEVH08100
	miniVE	8 × 9.5	8 × 10		IPVH08100	ISEQ08100		IEVH08100
	miniVE	8.5 × 10	10 × 10		IPVH10100	ISEQ10100	IPFL10100
	SE 400	14 × 16	15 × 15		IPVH15150	ISEQ15150
	SE 600	14 × 16	15 × 15		IPVH15150	ISEQ15150
	SE 600	14 × 8	13.5 × 8.5	■	IPVH08130	ISEQ08130
Bio-Rad	Mini-PROTEAN® 3 Dodeca™	8.3 × 7.3	8.4 × 7	■	IPVH07850	ISEQ07850	IPFL07810	IEVH07850
	Criterion™, Criterion™ Dodeca™	13.3 × 8.7	13.5 × 8.5	■	IPVH08130	ISEQ08130
	PROTEAN® II xi	16 × 16	15 × 15		IPVH15150	ISEQ15150
	PROTEAN® II xi	16 × 20	26.5 × 375		IPVH00010	ISEQ00010	IPFL00010
	PROTEAN® II XL	19.3 × 18.3	20 × 20		IPVH20200	ISEQ20200	IPFL20200
	PROTEAN® Plus Dodeca™	20 × 20.5	26 × 26		ISEQ304F0	ISEQ304F0
	Mini-PROTEAN® Tetra	8.3 × 7.3	8.4 × 7	■	IPVH07850	ISEQ07850	IPFL07810	IEVH07850
Invitrogen	XCell SureLock™ Mini-Cell	8 × 8	8.4 × 7	■	IPVH07850	ISEQ07850	IPFL07810	IEVH07850
Invitrogen	XCell4 SureLock™ Midi	8 × 13	8.5 × 13.5	■	IPVH08130	ISEQ08130
Thermo Scientific	Owl® P81, P82, P8DS	10 × 10	10 × 10		IPVH10100	ISEQ10100	IPFL10100
	Owl® P82, P8DS	8 × 10	8 × 10		IPVH08100	ISEQ08100		IEVH08100
	Owl® P9DS	16 × 16	15 × 15		IPVH15150	ISEQ15150
	Owl® P10PS	20 × 20.5	20 × 20		IPVH20200	ISEQ20200	IPFL20200

表4. Immobilon® PVDF预切转印膜和匹配的预制胶

Manufacturer	Vertical Gel Box	Gel size(cm)	Immobilon® Size (cm)	Immobilon® NOW format compatible	Immobilon®-P 0.45 μm	Immobilon®-PSQ 0.2 μm	Immobilon®-FL 0.45 μm*	Immobilon®-E 0.45 μm
Bio-Rad	Mini-PROTEAN™ TGX, Mini-PROTEAN™ TGX Stain-Free	8.6 × 6.8	8.4 × 7	■	IPVH07850	ISEQ07850	IPFL07810
Bio-Rad	Criterion™ TGX, Criterion™ TGX Stain-Free, Criterion™ Tris-HCl, Criterion™ Stain-Free Tris-HCl, Criterion™ XT Bis-Tris	13.3 × 8.7	13.5 × 8.5	■	IPVH08130	ISEQ08130
Lonza	PAGEr® Gold	9 × 10	8 × 10	■	IPVH08100	ISEQ08100		IEVH08100
Lonza	PAGEr® Gold	10 × 10	10 × 10		IPVH10100	ISEQ10100	IPFL10100
NuSep	nUView Tris-Glycine, Stain Free	8.6 × 6.8	8.4 × 7		IPVH08100	ISEQ08100	IPFL07810	IEVH07850
NuSep	nUView Tris-Glycine, Stain Free	8 × 8	8 × 10		IPVH08100	ISEQ08100		IEVH08100
Invitrogen	NuPAGE® , Bolt®	8 × 8	8.4 × 7	■	IPVH07850	ISEQ07850	IPFL07810	IEVH07850
	Novex®	8 × 8	8.4 × 7	■	IPVH07850	ISEQ07850	IPFL07810	IEVH07850
	E-PAGE	13.5 × 10.8	13.5 × 8.5	■	IPVH08130	ISEQ08130
Expedeon	RunBlue™ TEO-Tricine SDS	8 × 10	8 × 10		IPVH08100	ISEQ08100		IEVH08100
Expedeon	RunBlue™ Tris-Bis	10 × 10	10 × 10		IPVH10100	ISEQ10100	IPFL10100
Genscript	ExpressPlus™	8 × 10	8 × 10		IPVH08100	ISEQ08100	IPFL10100	IEVH08100
Genscript	SurePAGE™	8.6 × 6.8	8.4 × 7	■	IPVH07850	ISEQ07850	IPFL07810	IEVH07850
Millipore Sigma	mPAGE™	8.6 × 6.8	8.4 × 7	■	IPVH07850	ISEQ07850	IPFL07810	IEVH07850