一、认识体外诊断
体外诊断(IVD)是指在人体外通过对人体的血液等组织及分泌物进行检测获取临床诊断信息的产品和服务，可提供80%左右的临床诊断信息，目前，已经成为人类疾病预防、诊断、治疗日益重要的组成部分。
二、体外诊断试剂的标准
体外诊断试剂是按医疗器械管理要求的，包括在疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察和健康状态评价的过程中，用于人体样本体外检测的试剂、试剂盒、校准品、质控品等产品。可以单独使用，也可以与仪器、器具、设备或者系统组合使用。
由于体外诊断试剂在人的体外诊断过程中的重要作用，NMPA（原cFDA）对体外诊断试剂的产品标准有着严格的规定和要求，如准确度，精密度，重复性，再现性，以及最低检测限和灵敏度等。
三、体外诊断试剂的特别注意——微生物污染
微生物是造成体外诊断试剂污染的主要来源之一。如何预防微生物污染，保证检测试剂的精确度？如何保证产品在保质期内的品质？
防腐剂为我们提供了有效的解决方案，它是一类能够杀灭或抑制微生物生长的化学物质，在液体试剂中发挥着重要的防腐作用。
四、防腐剂的作用机理
防腐剂是能够杀灭或抑制微生物，特别是细菌和真菌生长的化学物质。它不是杀菌剂，没有很强的即时杀灭效果，只有在足够浓度并与微生物直接接触的情况下才能发挥作用。通过作用于微生物的细胞膜、细胞壁及酶等多个靶点，破坏细胞的分裂，抑制微生物的生长和繁殖，达到防腐的目的。实际上，防腐剂主要是对酶活力或对细胞原生质部分的遗传微粒结构产生影响的。例如，硫柳汞作用于巯基酶，而庆大霉素则作用于核糖体。总之，防腐剂是通过抑制细胞中基础代谢酶的合成或重要生命物质核酸和蛋白质的合成，起到阻碍细胞生长的作用。
五、防腐剂的一般选择原则
防腐剂的种类很多，如酸碱及其盐类、中性化合物类、汞化合物类、季胺化合物类等。防腐剂对微生物繁殖体有杀灭作用，但对芽孢则使其不能发育为繁殖体而逐渐死亡。不同类型的防腐剂其作用机理也不尽相同，如醇类能使病原微生物蛋白质变性；苯甲苯酸、尼泊金类等则能与病原微生物酶系统结合，竞争其辅酶；阳离子表面活性剂等则是通过降低表面张力作用，增加菌体细胞膜的通透性。
优良的防腐剂应具备以下特性：
① 加入防腐剂应能有效抑制在试剂盒制备、保存和使用过程中最有可能污染的一种或多种微生物的生长；防腐剂应对大多数细菌、真菌及酵母有较强的抑制作用；
② 防腐剂在试剂中有足够的溶解度，以保证其在两相或多相体系的试剂中具有足够浓度；
③ 在试剂盒的有效期内，防腐剂应非常稳定，不会因化学降解或挥发而降低浓度；防腐剂本身的理化性质和抗微生物性质应稳定，不易受热和样品pH值的影响，在长期贮存时不分解失效、不挥发，不沉淀，不与包装材料起作用；
④ 防腐剂不与试剂盒中的任何成分发生反应，不会影响试剂盒的检测效果或防腐剂的效果；
⑤ 使用成本低，容易获得。
六、常用的防腐剂分类
1、叠氮钠(sodiumazide．NaN3)
叠氮钠是体外诊断试剂中最常用的防腐剂之一，可抑制细菌生长，溶于水、液氨，不溶于乙醚，微溶于乙醇，用量一般为0.1%一0.5%。
叠氮钠优缺点：
多数情况下行之有效，但由于其含有氨基，会干扰辣根过氧化物酶(HRP)、超氧化物歧化酶、触酶等多种酶，所以一般含有HRP的试剂都不建议使用。同理，一般不用于抗体及酶免实验中的标本保存。
另外，它能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，因此也不适用于活体实验。同时，叠氮钠与氰化物相似，属于剧毒化合物，半数致死量为27mg/kg(大鼠，经口)，对细胞色素氧化酶和其他酶有抑制作用，并能使体内氧合血红蛋白形成受阻，有显著的降压作用。急性中毒出现头晕、头痛、全身无力、血压下降、心动过缓和昏迷。除对眼和皮肤有刺激性外，还可经吸入、口服或皮肤吸收引起中毒死亡，而且遇高热或剧烈震动能强烈爆炸，使用时应十分注意安全。出于安全方面的考虑，叠氮钠的使用日益受限。
2、硫柳汞(thiomersalatum，C9H902HgNaS)
硫柳汞作为防腐剂已有60多年历史，曾广泛用于生物制品中的疫苗及体外诊断试剂。硫柳汞稍有特殊臭味，微有引湿性，遇光易变质，易溶于水、乙醇，不溶于乙醚和苯，用量为0.001%～0.01%。它对革兰阳性和阴性菌均有很强的抑菌能力，为广谱抑菌剂。
硫柳汞优缺点：
其作用机理为重金属离子与菌体中酶蛋白的巯基结合而使酶失去活性，但对细菌抗原和血清蛋白的损害极其微弱，不能与酸、碘、铝等重金属盐或生物碱配伍。
硫柳汞为含汞化学物质，汞含量占到分子质量的50%，代谢或降解产物为乙基汞和硫代水杨酸盐，乙基汞是由二甲基汞降解的有机汞。由于少量有机汞在理论上具有神经毒性，因此硫柳汞的使用安全问题深受人们关注。
3、庆大霉素(gentamicin，C21H43N507)
庆大霉素是由绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌等发酵产生的氨基糖苷类抗生素，是由22一脱氧链霉胺、绛红糖胺、加拉糖胺组成的多组分混合物，并以C族复合物为主。其作用机理是直接与30S核糖体亚单位16SrRNA解码区的A部位结合，从而导至菌体死亡。
庆大霉素优缺点：
它的抗菌谱较广，对绿脓杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚变形杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素雷杆菌和志贺菌等革兰阴性菌有抗菌作用，对革兰阳性菌中的金黄色葡萄球菌也有很强的抗菌作用。（梅里埃生产的HIV诊断试剂中提到：对照血清的防腐用0.1g/L硫酸庆大霉素和0.2ml/L肉桂醛。）
但抗生素的缺点是容易产生耐药性，Jakobsen等曾报道了120株对庆大霉素耐药的大肠埃希菌的最小抑菌浓度(MIC)和耐药机制的关系。
4、ProClin® 防腐剂（推荐使用）
ProClin是商品化的异噻唑啉酮类防腐剂，是2种异噻唑啉酮类化合物的混合物，并含有一定量的硝酸镁及氯化镁。此类防腐剂是非常高效的防腐剂，对各种细菌、霉菌、酵母及藻类有很强的抑制作用，使用浓度为0.1%～0.02%(活性成分约为1.5%)。其作用机理为2种活性成分在与细胞膜接触几分钟后，可立即渗透到膜内并抑制细胞内酶的活性，从而抑制细胞生长代谢、大分子合成，引起细胞内能量水平迅速下降；由于能量体系的崩溃，细胞不能合成日常代谢所需要的化合物，从而导至菌体死亡。
ProClin® 防腐剂优缺点：
这类防腐剂能与氯及大多数阴、阳离子及非离子表面活性剂混溶，且在较高的使用浓度下不会影响酶活性。pH适用范围广(pH2～8.5)，化学稳定性好。经实验室检测，在25℃下保存2年，该防腐剂的活性组分仅损失3％，与水可以任意比混合。ProClin®系列防腐剂具有多标靶作用位点，因此大大降低了因变异产生的微生物的耐药性，是一种理想的可替代硫柳汞、叠氮化钠和庆大霉素的生物防腐剂。
但遇铵、亚硫酸盐、强还原剂和强碱性会降低其活性，在过量使用下有一定的刺激性和致敏性。
下面我们将着重来讲述ProClin®系列防腐剂。
为解决生物样本处理过程中保存期短的问题，SUPELCO公司（现默克生命科学下属的子品牌）推出新一代高效生物防腐剂ProClin™ 150，200，300，5000，可以有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长。当浓度达到0.02%条件下，ProClin®系列防腐剂具有广谱抗菌活性，能在比较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长；同时，它又能保持体系中酶的活性，因此它是一种理想的可替代硫汞撒、叠氮化钠和庆大霉素等生物防腐剂。
目前，传统的防腐剂由于剧毒、效率低的原因，已逐渐被新型防腐剂ProClin®防腐剂替代，并已被广泛用于超过1000种FDA认证的体外诊断试剂盒。
ProClin® 防腐剂的主要特点
• 广谱抗菌性，作用速度极快
• 与主要的酶及诱导剂兼容
• 不影响抗体结合
• 易于使用的水溶性液体,在极低浓度下依然有效
• 在很大批的pH范围内也能保持极佳的稳定性
• 使用HPLC即可测定活性组份(需要HPLC标准品)
• 在推荐使用浓度范围内，ProClin®不会引起任何危害健康、毒性及后处理问题
* 硫柳汞和叠氮化钠为剧毒品，作为防腐剂使用会极大地危害人体健康。
ProClin® 系列防腐剂作用原理
ProClin®的主要活性组份为两种异噻唑啉酮：
2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)；
5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMIT)。
在与微生物接触后的数分钟内，活性组份就能渗透过细胞壁从而抑制Krebs循环中某些特定酶的活性(如下图红色箭头所示)。微生物的生长、大分子合成及呼吸链反应被有效的抑制，最终导致细胞死亡。ProClin®系列防腐剂具有多标靶作用位点，因此大大降低了因变异产生的微生物的耐药性。随着KREBS循环被阻断，细胞产生能量和合成酶等生物活性物质的能力迅速下降，但其使用剂量却保持比较低的水平对人畜无害。
