辅酶Q10(CoQ10)检测试剂盒(微板法)

辅酶 Q(Coenzyme Q，CoQ)是一种生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，故又称泛醌，在体内呼吸链中质子移位及电子传递中起重要作用，是呼吸链中重要的递氢体，它是细胞呼吸和细胞代谢的激活剂，也是重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂。对多种酶有激活作用。不同生物体来源的辅酶 Q其侧链异戊烯单位的数目不同，人类和哺乳动物是 10个异戊烯单位，故称辅酶 Q10。辅酶 Q10是辅酶 Q类的重要成员之一，它们与线粒体内膜相结合，广泛参与体内的生物代谢过程。

辅酶 Q10不仅能给心脏提供动力，还具有**的抗氧化、清除自由基功能，能预防血管壁脂质过氧化，预防动脉粥样硬化，并且无任何毒副作用。具体作用体现在以下四个方面：

①帮助保护心脏辅酶 Q10有助于为心肌提供充足氧气，预防突发性心脏病，尤其在心肌缺氧过程中辅酶 Q10发挥关键性改善作用。

②保护皮肤长期使用辅酶 Q10能够有效防止皮肤衰老，减少脸部皱纹。

③抗疲劳辅酶 Q10使细胞保持良好健康的状态，因而机体充满活力，精力旺盛，脑力充沛。它是细胞自身产生的天然抗氧化剂和细胞代谢启动剂，具有保护和恢复生物膜结构的完整性、稳定膜电位作用，是机体的非特异性免疫增强剂，因此显示出极好抗疲劳作用。

④防癌抗癌研究表明，辅酶 Q10有抗肿瘤作用，临床对于晚期转移性癌症有一定疗效。

辅酶 Q10(CoQ10)检测试剂盒(微板法)其检测原理是待测样品在碱性条件下，EC取代了 CoQ10上的甲氰基，形成蓝色化合物，通过酶标仪测定 620nm处吸光度值，根据标准曲线即可测出辅酶 Q10的含量。本产品可用于测定花生、牛肉、沙丁鱼、保健品等食品中的 CoQ10的含量。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

产品组成：

自备材料：

1、无水乙醇、蒸馏水、三氯甲烷或正己烷等提取试剂

2、分光光度计或酶标仪、比色杯或 96孔板

操作步骤(仅供参考)：

1、稀释标准品：用 EC buffer稀释 CoQ10标准(5mg/ml)至 0.5mg/ml，-20℃保存备用。

2、准备样品：

①新鲜动物心脏或肝脏样品：用醇碱皂化法、溶剂皂化法等提取适量的 CoQ10提取液，-20℃保存备用。

②动物血清样品：0.1ml血清加入 0.9ml三氯甲烷，持续摇动 30min以上，使 CoQ10充分提取出来。如果检测结果较低，可以降低三氯甲烷的加入量。

③保健食品：参考 GB/T 22252-2008 《保健食品中辅酶 Q10的测定》中样本的提取方法。具体如下：根据试样中 CoQ10含量，称取 1～5g均匀试样(精确至 0.001g)，置于 25ml棕色容量瓶中，加正己烷 20ml，超声提取 20min后，加正己烷至刻度，摇匀，量取 1.0ml上述溶液于 10ml棕色容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，混匀，0.45μm滤膜过滤，滤液备用。

④酵母菌等发酵菌体样品：用醇碱皂化法提取，提取方法参考如下：

将湿菌体移入 150ml圆底烧瓶，加入 0.7g焦性没食子酸、2.5g氢氧化钾、19ml甲醇和7ml蒸馏水，混匀。90℃水浴锅中回流 30min，迅速冷却至室温，倒入分液漏斗中，加入石油醚(正己烷、三氯甲烷或丙酮)等有机溶剂 40ml，剧烈震荡 5min，萃取 CoQ10，连续萃取 2次，合并萃取液，用蒸馏水洗涤至中性，加入 5g无水硫酸钠干燥。用旋转蒸发仪 50℃浓缩至浓稠液，加入 10ml无水乙醇，放入冰箱冷冻析出胆固醇等杂质，过滤，滤液定容至 100ml待用。

3、CoQ10加样：按照下表设置空白、标准和测定，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的 CoQ10浓度过高，可适当减少样品用量或用 EC buffer稀释后再进行测定。

4、 CoQ10测定：混匀，室温避光孵育 3～5min，以空白管调零，比色杯光径 1cm，分光光度计或酶标仪 620nm(600～640nm亦可)处测定标准管或测定管的吸光度。

计算：

液体样品辅酶 Q10浓度：CoQ10(mg/ml)=A测定/A标准×0.5

液体样品辅酶 Q10含量：CoQ10(mg)= A测定/A标准×0.5×VT

每 100g固体样品辅酶 Q10含量：CoQ10(mg)= A测定/A标准×0.5×VT×100/m

式中：

A测定=测定管的吸光度

A标准=标准管的吸光度

0.5= CoQ10标准的浓度(mg/ml)

VT=CoQ10提取液的总体积(ml)

m=样品的实际用量(g)

注意事项：

1、待测样品中不能含有 CoQ10抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、在皂化过程中，震荡不要剧烈，以免形成乳化层。

3、CoQ10 Assay buffer如果出现浑浊或絮状物，应弃用。

4、CoQ10标准梯度应准确，尽量减少不必要的误差。

5、EC solution有一定毒性，请小心操作。

6、检测标准品时，按步骤 3表格混合后，2min内即出现明显的蓝色变化并逐渐加深，20min后蓝色开始变浅，30min后逐渐呈黄绿色。630nm检测数据表明，随着时间的延长，OD值在不断的下降，对应的颜色也已发生变化，特别是高浓度的标准品变化比较大。因此，应在出现最深的蓝色结果且稳定的时间段内尽快检测，而且建议每次同时检测标准品 (0.3～0.5mg/ml)和样品。如有条件，**用酶标仪检测，减少因检测时间导致的误差。

7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6个月有效。

附一：参考标准曲线范围： Leagene测定 CoQ10标准 0.04、0.1、0.3、0.5、1、2、5mg/ml在 630nm的吸光度，据此做出其标准曲线如下：

附二：CoQ10的提取方法(来源于网络，仅供参考)方法一、醇碱皂化法皂化液的制备取猪心残渣，压干称重，按干渣重加 300g/L工业焦性没食子酸，搅匀，加醇-碱溶液(干渣重 3～3.5倍量乙醇、320g/L氢氧化钠)，加热搅拌回流 25～30min，迅速冷却至室温，得皂化液。

浓缩液的制备取皂化液，立即加入其体积 1/10量的石油醚或 120号汽油提取 3～4次，搅拌，分层，得提取液。水洗至近中性，在 40℃以下浓缩至原体积的 1/10，冷却，-5℃以下静置过夜，过滤，得浓缩液。

辅酶 Q10精制品的制备将浓缩液过硅胶柱层析，先后用石油醚、10%乙醚-石油醚洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得黄色油状物。加热无水乙醇溶解，过滤，滤液静置，冷却结晶，真空干燥，得辅酶 Q10精制品。

方法二、醇醚混合溶剂提取法

辅酶 Q10粗制品的制备取猪心残渣，加 1.5倍量的 V乙醇：V乙醚=3：1混合溶剂，加热提取

3～4次，每次 15～20min，冷至室温，过滤，合并提取液。浓缩，加适量水，加石油醚提取，提取液浓缩，浓缩物为黄色油状物，即辅酶 Q10粗制品。

辅酶 Q10成品的制备取辅酶 Q10粗制品，加丙酮溶解，置-10℃以下析出杂质，过滤，滤液蒸去丙酮，加少量石油醚溶解，过硅胶柱层析分离，加无水乙醇结晶，得辅酶 Q10成品。