ABTS清除能力试剂盒
ABTS是一种介体物质，用 K2S2O8与 ABTS直接生成稳定的阳离子自由基 ABTS+，抗氧化物质与 ABTS+发生反应而使反应体系褪色。
ABTS+·自由基离子的最大吸收波长为 734nm，所以，用 A734 nm可以检测 ABTS+·自由基离子的浓度。如果 A734nm减小，表明 ABTS+·自由基离子被清除，进而对样本中 ABTS清除能力进行定量分析。
试剂盒的组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 粉剂 mg×2支 | 4℃保存 | 用前甩几下使粉剂落入底部 ，每支加0.49mL蒸馏水溶解(溶解后一周内用完)。 |
试剂二 | 粉剂 mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部 ，再加2.86mL蒸馏水，充分溶解备用。 |
标准品 | 粉剂 mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
工作液配置：临用前将加水溶解后的试剂一和试剂二按照 1:1比例混合，避光反应 12h后(二天内用完)，再用无水乙醇稀释 20-30倍备用(使 A空白管在 0.7±0.1，用乙醇稀释后的液体即工作液最好现配现用)。
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、甲醇、无水乙醇和蒸馏水。
ABTS自由基清除能力测定：
建议正式实验前选取 2个样本做预测定，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
①组织样本：
称取约 0.1g新鲜组织或者称取约 0.05g烘干样本(将样本在 105℃下杀青 3min，然后60℃烘干至恒重，粉碎，过 40目筛，得到烘干样本)，加入 1mL的 80%甲醇提取液(若鲜样需研磨均质)，于 60℃，200-300W条件下超声提取 30min(间隔 5min振荡混匀一次)，若有损失需用 80%甲醇定容至 1mL。12000rpm室温离心 10min，取上清测定。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例进行提取。
②细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500万细菌或细胞加入 1mL的 80%甲醇提取液进行匀浆；匀浆后转入 2mL离心管中；于 60℃，200-300W条件下超声提取 30min(间隔 5min振荡混匀一次)，若有损失需用 80%甲醇定容至 1mL。12000rpm，离心 10min，取上清置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104个)：提取液(mL)为 1000～5000: 1比例进行提取。
③液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
①酶标仪预热 30min以上，调节波长至 734nm。
②不同样本清除能力不一，可先选取 2个样本做检测，若 A测定-A对照接近零，需对样本进行稀释(用 80%甲醇提取液稀释)后再检测，稀释倍数 D代入公式计算。
③在 96孔板中依次加入：
| 试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 空白管 |
| 样本 | 10 | 10 | |
| 无水乙醇 | 190 | 10 | |
| 工作液 | 190 | 190 | |
| 混匀，室温(25℃)避光静置 6min，于 734nm处读取吸光值 A。 | |||
【注】若一次性样本较多，可用排枪或者分批检测，以使测定管的反应时间(避光静置 6min)保持一致。
结果计算：
1、标准曲线：y = 0.5042x - 1.4213，x是标准品 Trolox质量(μg/mL)，y是清除率(%)。
2、ABTS自由基清除率(%)=[(1-(A测定-A对照)÷A空白)×100]%
3、定义：用从标准曲线上获得的抗氧化剂Trolox的量来表示样本的ABTS自由基清除能力。
4、按样本质量计算：
ABTS自由基清除能力(μg Trolox/g鲜重)=[(清除率+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×W)×D=1.983×(清除率+1.4213)÷W×D
举例：若清除率是 70%，则用 70代入公式计算，即：
ABTS自由基清除能力(μg Trolox/g鲜重)=[(70+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×W)×D
5、按细菌或细胞数量计算：
ABTS自由基清除能力(μg Trolox/104 cell)=[(清除率+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×500)×D=1.983×(清除率+1.4213)÷500×D
举例：若清除率是 70%，则用 70代入公式计算，即：
ABTS自由基清除能力(μg Trolox/104 cell)=[(70+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×500)×D
6、液体样本：
ABTS自由基清除能力(μg Trolox/mL)=[(清除率+1.4213)÷0.5042]×D=1.983×(清除率+1.4213)×D
举例：若清除率是 70%，则用 70代入公式计算，即：
ABTS自由基清除能力(μg Trolox/mL)=[(70+1.4213)÷0.5042]×D
V---加入提取液体积，1 mL；
V1---反应中样品体积，10μL=0.01 mL；
W---样品质量，g；
500---细菌或细胞总数，万；
Trolox分子量---250.29；
D---稀释倍数，未稀释即为 1；
附：标准曲线制作过程：
1制备标准品母液(1mg/mL)：称取 2mg标准品即 Trolox至一新 EP管，再加 2mL甲醇充分溶解，即 1mg/mL标准品，备用。
2把母液用甲醇稀释成以下浓度梯度的标准品：0，20，40，60，80，100μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3按照测定管加样体系操作，依据结果即可制作标准曲线。
