人白细胞介素 7(IL-7)ELISA定量检测试剂盒

实验原理

本试剂盒采用双抗体夹心两步法酶联免疫吸附试验(ELISA)。在预包被抗人白细胞介素7(IL-7)抗体(固相抗体)的微孔酶标板中，加入人白细胞介素 7(IL-7)校准品和待测样本，再加入生物素标记抗体，经过温育与充分洗涤后，再加入 HRP偶联的亲和素，经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-生物素标记抗体-亲和素酶的夹心复合物。加底物 A和 B，产生蓝色产物，在终止液作用下，最终转化为黄色，在酶标仪 450nm波长上测定吸光度(OD值)，吸光度(OD值)与待测样品中人白细胞介素 7(IL-7)的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中人白细胞介素 7(IL-7)的浓度。

试剂盒限制性

1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。

2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。

3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。

4、使用试剂盒配套的样品稀释液。

5、如果样本值高于最高标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。

6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排出该因素。

7、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。

技术提示

1、混合蛋白溶液时，避免起泡。

2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。

3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。

4、使用自动洗板机时，加入一个 30秒浸泡的步骤，可以提高检测精度。

5、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。

6、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。

7、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封(低温干燥)保存。

8、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

试剂盒组分与保存

未开封的试剂盒保存在 2-8度，不得使用过期试剂盒。

校准品浓度依次为：2400、1200、600、300、150、75、0  pg/mL。

其他用品

1、酶标仪(450nm)

2、精密移液器及一次性吸头

3、蒸馏水

4、洗瓶或者自动洗板机

5、37℃水浴锅或恒温箱

6、500ml量筒

生物安全

1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。

2、试剂盒的液体组分中，含有 proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。

3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。

4、戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。

样品的采集和储存

以下只是列出样品采集和保存的一般指南。所有样本采集保存过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。

1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。

2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心 20min，小心地分离出血清，保存在-  20℃以下，避免反复冻融。

3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在 4000rpm条件下，离心 20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下

解冻，确保样品均匀充分解冻。

4、组织匀浆：用预冷的 PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS(一般按 1: 9的重量体积比，比如 1g的组织样品对应 9 mL的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液 5000×g离心 5-10分钟，取上清检测。

5、细胞提取液：贴壁细胞用冷的 PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心 5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的 PBS洗涤 3次。每 1×10⁶个细胞中加入 150-200μL  PBS重悬并通过反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少 PBS的体积)。将提取液于 1500×g离心 10分钟，取上清检测。

6、其他生物体液：1000×g离心 20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

试剂准备

1、使用前，所有的组分都要至少复温 60min，确保充分复温到室温。

2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按 1:20稀释，即 1份的浓缩洗涤液，添加 19份的蒸馏水。

3、底物：底物液 A和 B，在使用前，按 1:1体积充分混合，混合后 15分钟内使用。

操作程序

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。

1、按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

3、设置标准品孔、样本稀释液孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL，样本稀释液孔加样本稀释液 50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本 50μL。除空白孔外，每孔加入生物素抗体 100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育 60min。

4、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复 5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡

30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

5、除空白孔外，每孔加入 HRP标记亲和素 100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育 20min。

6、重复步骤 4。

7、将底物  A和 B按 1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液 100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育 15min。

8、所有孔加入终止液 50μL，在 450nm波长酶标仪上读取各孔吸光度(OD值)。

结果计算

9、以标准品浓度做为横坐标，对应的吸光度(OD值)作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic曲线拟合(4-pl)，创建标准曲线方程，通过样本的吸光度(OD值)，利用方程计算样品的浓度值。【用 ELISA  Calc软件计算】

10、如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

(示意图，仅供参考)

试剂盒性能指标

1、物理性能试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破

损漏气。

2、剂量反应曲线线性

校准品剂量反应曲线相关系数 r值，大于等于 0.9900。

3、精密度批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。

批内变异系数 CV%小于 10%。

批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数 CV%小于 15%。

4、灵敏度

最低检出剂量小于 10  pg/mL。

5、回收率

三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在 85%-115%之间。

6、特异性

本试剂盒识别天然和重组人白细胞介素 7(IL-7)，与结构类似物无交叉。

7、稳定性

2℃-8℃保存，有效期 6个月。

8、检测范围

75 pg/mL – 2400 pg/mL。