Tth DNA聚合酶

2.7.7.7 ( BRENDA | IUBMB )

Tth DNA聚合酶是从嗜热真细菌Thermus thermophilusHB8中分离出来，纯化后没有非特异性脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶。这种酶是一种进行性5′-3′DNA聚合酶，没有3′-5′核酸外切酶活性。该酶在大约pH9(+25℃调整)，温度+75℃时活性最高。它在高温(95℃)延长反应中依然保持活性。

嗜热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶能用于：

• 通过聚合酶链反应(PCR)扩增DNA片段，由于其在高温(95℃)长时间培育依然保持活性
• 放射性标记核苷酸、地高辛或生物素标记的DNA片段，由于其能将修饰的脱氧核糖核苷酸用作底物
• 有效地将靶标RNA转录为cDNA，由于其内在的Mn依赖性逆转录酶(RT)活性
• 用于实时PCR

嗜热菌(Thermus thermophilus)(Tth) DNA聚合酶是一种具有热稳定性的DNA聚合酶，有逆向转录酶活性。此酶是高度进行性的5′-3′DNA聚合酶，缺乏3′-5′核酸外切酶活性(校对)。 内在的逆向转录酶(RT)活性在镁离子存在的条件下，转录效率高远高于大肠杆菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶的转录效率。RT 活性和核酸酶H活性无关。Tth DNA聚合酶在较高的温度范围(最佳范围+55℃到+70℃，最高温度+95℃)依然有活性，克服了RNA二级结构问题。生成的cDNA在Mg²⁺存在的情况下，可通过相同的酶进行PCR扩增。Tth DNA聚合酶能够在较高的温度范围进行逆向转录和DNA扩增，因此可用于对细胞和病毒RNA进行定量RT-PCR、克隆和基因表达分析。Tth DNA聚合酶可用于最多1kbRNA RT-PCR扩增。

Tth DNA聚合酶：

• 确保优化聚合酶链反应(PCR)得到的产品大小在RT-PCR反应中至少达到1,000 bp
• 可将修饰的脱氧核糖核苷三磷酸用作底物
• 与核酸酶 H活性无关
• 具有高温热稳定性可以克服该问题，高温热稳定性通常与RNA中存在的高级二级结构有关

每一批次的Tth DNA聚合酶均在活化的DNA上进行了活性分析。我们使用λDNA和人类基因组DNA进行功能测试。使用小鼠全RNA和β-actin的特异性引物开展RT/PCR分析。针对每一批次的Tth DNA聚合酶，我们均按照当前质控流程进行检验，确保其中不存在外切核酸酶和内切核酸酶活性，以及具有切割活性的污染物。依照当前的质控流程，我们还采用了一套独特的自启动检测来确保产品中不存在DNA污染。

一单位Tth DNA聚合酶的定义为，在+70 ℃下，在30分钟时间内将10 nmol总dNTP催化整合为酸性可沉淀DNA所需的酶量，这一检测条件在“单位检测”中有具体说明。

单位检测：孵育缓冲液，用于分析活化的DNA
67 mM Tris-HCI, pH 8.8 (+25 ℃)， 16.6 mM (NH₄)₂SO₄，6.7 mM MgCl₂，10 mM 2-巯基乙酸，dATP，dCTP，dGTP，dTTP 每种0.2mM。

孵育步骤
在+70 ℃下，将12.5 μg 激活的鲱鱼精子DNA和0.1 μ Ci [α³²P] dCTP与0.01至0.1 个单位的Tth DNA聚合酶在50 μl孵育缓冲液中共同孵育(有石蜡油保护)30分钟。
随后通过三氟乙酸沉淀法和闪烁计数来确定整合的dNTP量。

体积活性：单一PCR(经优化)反应需0.5至5 U
单次PCR(标准)反应需2.5 U
激活DNA分析的测定结果在“单位检测”部分中进行描述。

仅用于生命科学研究。不可用于诊断。

本产品的使用受到美国专利及其对应的境外专利声明保护。购买本产品，即相当于依照境外的专利声明获得了一份受限制、不可转让的使用许可，即将此等数量的产品仅用于购买者′内部的研究用途。不享受任何其他专利权利。无权进行任何商业活动，包括无批准报告购买者使用结果，免费使用等。不能给出任何商业暗示。禁止反言。本产品仅适合于研究用途。如需用于Roche专利许可的诊断用途，需要获得一份独立的Roche许可。有关购买许可的更多信息，可联系Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA获取。

组份不可单独销售
PCR Buffer, including MgCl₂ 10x concentrated
RT-PCR Buffer, coupled reaction in one tube 5x concentrated
Mn(OAc)₂-Solution 25 mM

sufficient for ≤200 reactions

100

Roche

75 ℃ optimum reaction temp.

~9.0 (25 ℃)

dry ice

−20℃

1个试剂盒包含3个组分

12 - Non Combustible Liquids

WGK 1