分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。

一、分光光度计原理

分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比，其关系为：A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc  式中：A 为吸光度；I。为入射的单色光强度；I 为透射的单色光强度；T 为物质的透射率；k 为摩尔吸收系数；L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长；c为物质的浓度。

物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。

二、分光光度计使用方法步骤

1) 预热仪器。为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min，为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器时和在不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。

2) 选定波长。根据要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色光波长。

3) 固定灵敏度档。根据有色溶液对光的吸收情况，为使吸光度读数为0.2-0.7，选择合适的灵敏度。为此，旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程中不再变动。一般测量固定在“1”档。

4) 调节“0”点。轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0”处(此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照)。

5) 调节T=100%。将盛蒸馏水(或空白溶液或纯溶剂)的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，有色溶液放在其它格内，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，转动光量调节器，使透光度T=100%，即表头指针恰好指在T=100%处。

6) 测定。轻轻拉动比色皿座架拉杆，使有色溶液进入光路，此时表头指针所示为该有色溶液的吸光度A。读数后，打开比色皿暗箱盖。

7) 关机。实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。

三、 主要项目对分析结果的影响

1) 波长准确度

分光光度法原理要求照射在样品池上的单色光必须对应于样品吸收光谱中的某一个吸收峰的波长。由于仪器的制造和调整误差，单色光的实际波长与仪器的波长读数值间都存在一定的误差。样品中绝大部分的主要吸收峰都有一定的宽度，对波长准确度要求允许宽些。但是，当吸收峰宽度较小，而且吸收峰两侧边缘比较陡直，此时波长准确度的影响就必须引起注意。

2) 透射比（吸光度）准确度

很显然,透射比或吸光度的误差越大,测试结果的可信性越差,从而影响到测试数据的准确性。

3) 杂散光

杂散光是由于光学元件制造误差以及光学和机械零件表面的漫反射形成的。杂散光是分析样品的非吸收光，随着样品浓度的增加，杂散光的影响也随之增大，将给分析结果带来一定的误差。在紫外的短波区域光源强度和检测器的灵敏度均明显减弱，杂散光的影响更不能忽视。因此，杂散光的大小也是仪器性能的一项重要指标。

使用与维护

1）若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新校正“0”和“100%”点。然后再测量。

2）指针式仪器在未接通电源时，电表的指针必须位于零刻度上。若不是这种情况，需进行机械调零。

3）比色皿使用完毕后，请立即用蒸馏水冲洗干净，并用干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。

4）操作人员不应轻易动灯泡及反光镜灯，以免影响光效率。

5）WFZ800-DA、756型等分光光度计，由于其光电接收装置为光电倍增管，它本身的特点是放大倍数大，因而可以用于检测微弱光电信号，而不能用来检测强光。否则容易产生信号漂移，灵敏度下降。针对其上述特点，在维修、使用此类仪器时应注意不让光电倍增管长时间暴露于光下，因此在预热时，应打开比色皿盖或使用挡光杆，避免长时间照射使其性能漂移而导致工作不稳。

6）放大器灵敏度换挡后，必须重新调零。

7）比色杯的配套性问题。比色杯必须配套使用，否则将使测试结果失去意义。在进行每次测试前均应进行比较。具体方法如下；分别向被测的两只杯子里注入同样的溶液，把仪器置于某一波长处，石英比色杯；220nm、700nm装蒸馏水，玻璃比色杯：700nm处装蒸馏水，将某一个池的透射比值调至100%，测量其他各池的透射比值，记录其示值之差及通光方向，如透射比之差在±0.5%的范围内则可以配套使用，若超出此范围应考虑其对测试结果的影响。

四、分光光度计操作使用过程中的注意事项

1) 为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。

2) 比色皿的使用方法：

① 拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

② 清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液(1:2)浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。每次做完实验时，应立即洗净比色皿。

③ 比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。

④ 测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。

⑤ 在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。

五、分光光度计分操作中容易出现的几个典型故障及其排除方法

1）仪器不能调零。可能原因：

① 光门不能完全关闭。解决方法：修复光门部件，使其完全关闭。

② 透过率“100%”旋到底了。解决方法：重新调整“100%”旋钮。

③ 仪器严重受潮。解决方法：可打开光电管暗盒，用电吹风吹上一会儿使其干燥，并更换干燥剂。

④ 电路故障。解决方法：送修理部门，检修电路。

2) 仪器不能调“100%”。可能原因：

① 光能量不够。解决方法：增加灵敏度倍率档位，或更换光源灯(尽管灯还亮)。

② 比色皿架未落位。解决方法：调整比色皿架使其落位。

③ 光电转换部分老化。解决方法：更换部件。

④ 电路故障。解决方法：调修电路。

3) 测量过程中,“100%”点经常变动。可能原因：

① 比色皿在比色皿架中放置的位置不一致，或其表面有液滴。解决方法：用擦镜纸擦干净比色皿表面，然后将其安放在比色槽的左边，上面用定位夹定位。

② 电路故障(电压、光电接收、放大电路)。解决方法：送修。

4) 数显不稳。可能原因：

① 预热时间不够。解决方法：延长预热时间至30分钟左右(部分仪器由于老化等原因，长时间处于工作状态时，也会工作不稳)。

② 光电管内的干燥剂失效，使微电流放大器受潮。解决方法：烘烤电路，并更换或烘烤干燥剂。

③ 环境振动过大、光源附近空气流速大、外界强光照射等。解决方法：改善工作环境。

④ 光电管、电路等其它原因。解决方法：送修。